本发明公开一种“猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒和猪嵴病毒"的5重RT-PCR检测方法以及试剂盒。本发明的试剂盒中包括有10条特异性扩增引物，在其使用时以待检样品的总RNA，利用6碱基随机引物反转录为 CDNA，再以cDNA为模板利用试剂盒中的检测反应体系进行RCR扩增，根据不同病原所扩增的PCR片段大小不同来判定待检样品是否感染一种病原，或是混合感染。本发明的试剂盒在保证特异性和敏感性的情况下，具有操作简单、快速，降低了检测成本、劳动强度的优点，可适用于田间样品检测。